反义寡核苷酸中残余硫化剂的测定搅拌机构冰块机煤球机节电系统注射机Oe

反义寡核苷酸中残余硫化剂的测定

反义寡核苷酸即反义核酸（antisense oligonucleotide），其核苷酸序列可与靶RNA或靶DNA互补，抑制或封闭基因的转录和表达，或诱导RnaseH识别并切割mRNA，使其丧失功能。反义核酸药物是药理学的新领域或新革命［1］，是目前所知最精确、高效及最具广泛意义的调控特异基因表达的潜在策略，它既可以作为研究工具，用于对一些特定蛋白和基因的生理功能的研究，也可作为治疗药物用于癌症、感染性疾病等许多疾病的治疗。然而反义寡核苷酸的功能在很大程度上取决于其稳定性、生物利用度及与靶基因结合特性，通过特定的化学修饰可以改变这些物理化学特性，从而增加抗病毒、抗肿瘤和其他特定基因的表达抑制活性。以硫代磷酸酯为骨架修饰的硫代寡核苷酸（磷酸二酯骨架中的非桥氧原子被硫取代）是最广泛研究的反义核酸，现在进入临床的所有ODN几乎都是PS-ODN［2］，它具有抗核酸酶水解、良好的亲核性、方便的同位素标记等特点。

常见的硫代修饰剂有Beaucage试剂（3H-1,2-Benzodithiol-3-one-1,1-dioxide,简称B）和二硫化四乙基秋兰姆（Tetraethylthiuram disulfi目前我国医疗器械细分行业众多de,简称T）等，结构式见图1。然而反义核酸中残余的硫化剂对反义药物本身有副作用，对生物体也有一定毒性。因此，在反义寡核苷酸药物的质量控制中需要确定它们的残余量。

1 实验部分

1．1仪器与试剂

HP 5890气相色谱仪，配FID检测器，HP 3394自动积分仪，HP 5971高性能台式气相色谱-质谱联用仪，配有WILLY138谱库，ZabSpec高分辨磁质谱仪，PE 235高效液相色谱仪。

标准品B和T购自Sigma公司(纯度均大于99%)，巯基乙醇为Fluka公司，其它试剂均为色谱纯。

1．2分析条件

气相色谱条件：HP-1非极性柱(30mγTM0.52mmγTM 0.32 μm)；柱温采用程序升温：初温150℃，保持3分钟，以10℃/分钟升温至250℃，保持10分钟；进样器温度250℃；检测器温度270；载气为高纯氮，流速1.2mL/min；分流比15：1；分流进样，进样量体积为1.0μL。

气相色谱-质谱条件：HP-5TA柱(30mγTM0.25mmγTM 0.25 μm)；柱温采用程序升温：初温80℃，以15℃/分钟升温至250℃，保持10分钟；进样器温度250℃；检测器温度280℃；载气为高纯氦（纯度 99.999%），流速32cm/min；柱头压11.5psi；儿童牛奶分流进样，进样量1.0μL投影仪的使用注意事项电离方式为电子轰击（EI），接口温度170℃，传输线温度250℃，电子能量70eV，电子倍增器电压1.3eV，溶剂延迟3分钟。

高效液相色谱条件：反相色谱柱（250mmγTM4.6mm，BIO-RAD公司），流动相为V（甲醇）：V（水）=70：30的溶液，流速1.0mL/min；检测波长220nm；柱温45℃，进样量50μL。

1．3标准溶液的配制

精密称取 SPAN lang=EN-US 11.0mg的B置于10mL容量瓶中，用苯定容，配制成1.10mg/mL的标准储备液，逐级稀释至所需要的浓度。同样，将T配制成1.17mg/mL的标准储备液。

1．4化学衍生化

<鄂尔多斯p>取0.5钢玉磨料mL的标准储备液，加入0.5μM的NH4HCO3缓冲液再加入浓度为1.114g/mL的巯基乙醇10μL，在55℃水浴中反应。每隔一小时采样150μL，立刻冷却至-20℃保存，总共采样6次。将得到的样品经反相HPLC和磁质谱检测。结果表明反应4h时，衍生化进行完全，并且试药与巯基乙醇的质量分数比为2：1时，衍生化效果最佳。

2 结果与讨论

2.1 气相色谱条件的优化

2.1.1 溶剂的选择

分别用二硫化碳、三氯化碳、丙酮、二氯化碳、四氢呋喃、乙腈和苯作溶剂，样品在上述溶剂中都有良好的溶解性，但除乙腈和苯之外，在气相色谱图上都有溶剂脱尾现象和溶剂对进样针的浸润作用，故考察选用乙腈和苯作溶剂。又从峰形和测定重复性方面考察，苯比乙腈的使用效果好，因此，实验中选用苯作溶剂。

2.1.2 色谱柱的选择

选用极性柱HP- INNOWax、中极性柱BP-225和非极性柱HP-1三种气相色谱柱进行实验，均可进行检测。但使用前二种色谱柱，色谱峰拖尾比较严重，因此会影响分析方法的精密度和线形范围。使用后一种色谱柱HP-1能够克服这一不足。

2.1.3 柱温的选择

考察了恒温和程序升温二种情况，在分离度和最低检测限量方面，程序升温好于恒温，并经反复实验比较不同升温方式，确立最佳升温程序。同时，在选择初始柱温时，既要考虑能缩短分析周期，又要考虑被检测物的灵敏度。当该温度在100℃~150℃时，单位进样量的峰高基本不变，但当该值大于150℃时，色谱峰明显拓宽，峰高度显著降低。因此，初始柱温选择150℃比较合适。

202 气相色谱-质谱的测定

将B和T的衍生化样品分别进行GC/MS全扫描分析，质谱图见图2和图3。由图2、图3可知，B和T的基峰分别为168和116。分别以m/z 168, m/z 116的离子作为特征目标监测离子，同时以保留时间及WILEY138谱库的检索结果对样品做进一步确证，确保结果准确可靠。

2.3 检出限与线性范围

B和T标准品的色谱图见图4和图5。为了确定它们的最低检测限量和线性范围，对不同浓度的标准溶液进行分析，得到了不同进样量的色谱峰面积及峰高。以色谱峰高度是基线噪声高度的2倍作为标准计算最低检测限量，则B的最低检测限量为50mg/mL,T的最低检测限量为100mg/mL。

两种硫化剂的线性回归方程如下：

B：Y=14228X-248846,r=0.995；

T: Y=13158X-343695,r=0.998

其中X为进样量，Y为色谱峰面积，线性范围：150mg/mL-1100mg/mL。

宠物寄养3.结语

消费者有理由相信在日趋完善的服务体系和良好的服务态度下 反义寡核苷酸是一类新型药物，有关研究历史不长，特别是还未建立系统的药物质量控制标准与检验方法标准。测定反义寡核苷酸中残余硫化剂，由于课题工作量大，多步骤展开研究，因此，研究时间紧张。本课题研究了二类最常用硫化剂，尚有其它硫化剂未涉及，还有待继续研究。

得百宁贴几个疗程有效
孩子拉肚子腹部不适怎么能缓解
得百宁可以缓解带状疱疹疼痛吗
腰膝酸软吃什么食物比较好